Autotestes covid 19 ou testes rápidos de antigénio nasais ou TRAg (N) qual o melhor? Em comunicado tornado público pelo INFARMED em 19/03/2021, no contexto da atual situação epidemiológica provocada pelo novo coronavírus SARS-CoV-2 e pela doença COVID-19, o Ministério da Saúde tem vindo a adotar e implementar medidas com vista à prevenção, contenção e mitigação da transmissão do SARS-CoV-2 e da referida doença, declarada como pandemia pela Organização Mundial da Saúde, a 11 de março de 2020.
Neste sentido, a Estratégia Nacional de Testes para SARS-CoV-2 foi formalizada através da Norma nº 019/2020 da Direção-Geral da Saúde, a qual é adaptável à situação epidemiológica da COVID-19 a nível regional e local, bem como aos recursos disponíveis.
De acordo com o enunciado da referida Norma, os testes para deteção de SARS-CoV-2 são utilizados para fins de diagnóstico da COVID-19, em doentes com suspeita de infeção e em contactos com caso confirmado, e para fins de rastreio em populações vulneráveis, nas Unidades de Saúde e em contextos comunitários e ocupacionais, em pessoas sem evidência ou suspeita de infeção. Terão um papel relevante se novas variantes se tornarem prevalentes e mais infeciosas.
Testes de deteção de componentes do vírus
Ainda, é determinado que o diagnóstico e o rastreio de infeção por SARS-CoV-2 deve ser realizado exclusivamente por testes de deteção de componentes do vírus, existindo para esse efeito os seguintes tipos de teste:
- Testes de amplificação de ácidos nucleicos (como por exemplo o RT-PCR) que detetam o RNA do vírus;
- Testes rápidos de antigénio (TRAg) que detetam proteínas do vírus, que reagem com os anticorpos presentes na placa do teste rápido. Os autotestes (para fazer em casa) enquadram-se nesta categoria.
Anteriormente, os TRAg disponíveis no mercado europeu para este fim eram destinados apenas para uso profissional. Inicialmente estes testes apenas previam a sua realização em amostras do trato respiratório (superior e/ou inferior) nomeadamente exsudados nasofaríngeos e/ou orofaríngeos. No entanto, mais recentemente têm vindo a ser disponibilizados TRAg validados para utilização com amostras colhidas por métodos menos invasivos, nomeadamente, amostras da área nasal interna (fossas nasais).
Uma vez que um dos fatores facilitadores da utilização dos TRAg por leigos, nomeadamente autotestes, é a simplificação do processo de colheita, a possibilidade de uma colheita menos invasiva, que dispense a intervenção de profissionais habilitados, permite e favorece a realização do teste pelo próprio.
Deste modo, a viabilidade da Auto colheita, aliada ao formato de teste rápido que é caracterizado por uma baixa complexidade de execução técnica, o que permite o seu uso fora de um ambiente laboratorial, veio possibilitar a realização de autotestes para a deteção de antigénio de SARS-CoV-2 (autoteste SARS-CoV-2).
Os autotestes covid 19 SARS-CoV-2 constituirão assim um instrumento adicional de reforço da resposta nacional de combate à COVID-19, e também acompanhando a vacinação já em curso.
Lista de autotestes covid aprovada
A lista pública de autotestes covid 19 aprovados pelo INFARMED e portanto que podem ser vendidos em farmácias para fazer em casa é ainda muito curta. De seguida descrevo a última lista publicada pelo INFARMED.
Desta forma, e de acordo com o previsto no artigo 2.º da Portaria nº 56/2021, de 12 de março, a presente circular visa estabelecer os critérios de inclusão no regime excecional para a utilização de testes rápidos de antigénio de uso profissional por leigos, bem como orientar a operacionalização da sua utilização e da comunicação de resultados às Autoridades de Saúde.
Consulte na Circular (em anexo):
1. Requisitos gerais dos autotestes SARS-CoV-2
2. Limitações dos autotestes SARS-CoV-2
3. Regime excecional (Lista de TRAg incluídos no regime excecional)
4. Operacionalização da utilização e reporte de resultados dos autotestes SARS-CoV-2
A circular ora publicada refere os requisitos que os testes rápidos de antigénio SARS-CoV-2 devem cumprir de forma a serem submetidos e autorizados pelo Infarmed para utilização como autoteste.
Uma vez aprovados estes testes para efeitos de dispensa e utilização pelos utentes, a respetiva lista será publicada, actualizada periodicamente e disponibilizada no site do Infarmed.
Autotestes Covid 19 qual o melhor?
Escolher o melhor autoteste (para fazer em casa), entre os diversos que vão fazer parte da lista aprovada pelo INFARMED não é uma tarefa fácil pois dos requisitos mínimos fazem parte inúmeros pressupostos legais conforme listagem que descrevo de seguida e que um teste de comprovada qualidade tem de cumprir, a saber:
- Descrição do dispositivo, sendo que o teste deverá incluir obrigatoriamente todos os componentes necessários para a colheita, nomeadamente zaragatoa, e para a execução do teste;
- Identificação de CDM (Código de Dispositivo Médico);
- Marcação CE para o uso profissional, de acordo com a DIR 98/79/CE, e apresentação da respetiva Declaração CE de conformidade;
- Evidência de validação por parte de um laboratório europeu reconhecido pelo respetivo Estado Membro, ou acreditado para os métodos em questão;
- Dados de desempenho para amostras nasais, devendo o teste apresentar pelo menos uma sensibilidade igual ou superior a 80% e uma especificidade igual ou superior a 97%, de acordo com a informação do fabricante, sendo o método de comparação a considerar para o efeito o RT-PCR em amostras nasofaríngeas ou orofaríngeas (método de referência);
- Para a determinação da sensibilidade terá de ser considerada uma amostra mínima de 100 amostras positivas. Estas amostras devem apresentar uma distribuição equilibrada e variada nas diferentes gamas de Cts (Cycle Threshold) (10 < Cts < 33);
- Para a determinação da especificidade terá de ser considerada uma amostra mínima de 100 amostras negativas;
- Os valores de sensibilidade terão de ser apresentados em correlação com os valores de Ct tomando como referência o resultado obtido em amostras paralelas por RT-PCR.
- Declaração relativa à capacidade do teste de detetar as variantes genéticas conhecidas do SARS-CoV-2, bem como o compromisso por parte do fabricante de continuamente avaliar o impacto que novas variantes genéticas possam ter no seu dispositivo, de forma a assegurar o desempenho do teste, e garantir que este continua a cumprir os requisitos para a finalidade que lhe foi atribuída.
- Exemplar de instruções de utilização em português, e adaptadas ao autoteste, com ilustração do processo de colheita e de execução do teste, incluindo a seguinte informação: método de eliminação de resíduos, informação sobre ações a adotar perante o resultado obtido, e procedimento de comunicação dos resultados;
- Exemplar de rotulagem e instruções de utilização que incluam a seguinte menção: “Autoteste COVID-19 – Regime Excecional”;
- Apresentação comercial adaptada à utilização em contexto de autoteste;
- Demonstração do cumprimento dos pontos críticos da norma EN 62366-1:2015 – Dispositivos médicos – Parte 1: Aplicação de engenharia de aptidão à utilização dos dispositivos, incluindo a análise de risco atualizada, identificando os riscos resultantes da utilização do teste como autoteste;
- Cumprimento dos requisitos listados no ponto 7 do anexo I da DIR 98/79/CE;
- Comprovativo de autorização para a utilização do teste, como autoteste, atribuída por outros Estados Membros, se aplicável.
Sensibilidade e especificidade
A sensibilidade mede a capacidade de detetar quantidades muito pequenas de componentes do vírus. Assim quanto mais pequena for a quantidade detetável mais sensível é o teste.
A especificidade mede a capacidade de detetar os componentes de um determinado vírus sem ser afetada, por exemplo, pela presença de outros vírus, bactérias ou outras substâncias presentes na amostra ou seja a capacidade de detetar o vírus numa amostra “contaminada” com outros microorganismos ou moléculas diferentes.
O padrão de comparação para determinação do grau de sensibilidade e especificidade são os testes PCR que detetam o RNA do SARS-CoV-2 por serem os testes moleculares mais sensíveis e específicos.
De seguida descrevo em detalhe a informação específica de um teste de excelente qualidade inteiramente produzido em Portugal e que tenho quase a certeza que será aprovado pelo INFARMED.
Utilização pretendida
O Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) ou TRAg (N) é um teste de fluxo lateral que se destina à deteção qualitativa de antigénios da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 em esfregaço nasal diretos de indivíduos com suspeita de COVID-19.
O kit destina-se a utilização profissional se for de amostra nasofaríngea ou como autoteste covid se for de amostra nasal anterior interna ou seja na cavidade nasal mais próxima da entrada do nariz, utilizando uma zaragatoa mais curta e espessa.
Os resultados destinam-se à identificação de antigénios da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2. Os antigénios são geralmente detetáveis em esfregaços nasal/nasofaríngeos/orofaríngeos durante a fase aguda da infeção.
Os resultados positivos indicam a presença de antigénios virais, mas é necessária correlação clínica com os antecedentes do doente e são necessárias outras informações de diagnóstico para determinar o estado da infeção. Resultados positivos não excluem infeção bacteriana ou coinfecção com outros vírus. O agente detetado pode não ser a causa
definitiva da doença.
Resultados negativos de doentes com início de sintomas há mais de sete dias devem ser tratados como presumíveis e poderá realizar-se uma confirmação com um teste molecular, se necessário para a gestão do doente. Resultados negativos não excluem infeção por SARS-CoV-2 e não devem ser utilizados como a única base para decisões de gestão e tratamento de doentes, incluindo decisões de controlo de infeções.
Os resultados negativos devem ser considerados no contexto das exposições recentes do doente, antecedentes e presença de sintomas e sinais clínicos compatíveis com a COVID-19.
Introdução
O novo coronavírus pertence ao género β. A COVID-19 é uma doença infeciosa respiratória aguda. As pessoas são normalmente suscetíveis. Atualmente, os doentes infetados com o novo coronavírus são o principal foco de infeção; as pessoas infetadas assintomáticas também podem ser um foco de infeção. Com base na investigação epidemiológica atual, o período de incubação é de 1 a 14 dias, sobretudo 3 a 7 dias. As
principais manifestações incluem febre, fadiga e tosse seca. Em alguns casos, foram observados congestão nasal, corrimento nasal, dor de garganta, mialgia e diarreia
Como funciona
Este produto utiliza imunocromatografia com ouro coloidal de captura para detetar qualitativamente antigénios da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 em amostras humanas de esfregaços nasais. São utilizados anticorpos e anticorpos IgY de galinha marcados com ouro coloidal. O complexo ouro coloidal-anticorpo do SARS-CoV-2 e o
complexo ouro coloidal-anticorpo IgY de galinha são revestidos na almofada conjugada.
A linha de teste é revestida com anticorpo do SARS-CoV-2 e a linha de controlo (C) é revestida com anticorpo IgY de cabra anti-galinha. Se o antigénio da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 estiver presente na amostra, o antigénio do SARS-CoV-2 e o anticorpo marcado com ouro coloidal formam um complexo. Sob a ação da cromatografia, o complexo avança ao longo da tira e, quando chega à linha de teste (T),
reage com o anticorpo do SARS-CoV-2 pré-revestido para formar um imunocomplexo e surge uma linha vermelha, sendo neste caso um teste positivo ao SARS-CoV-2.
O anticorpo IgY de galinha marcado com ouro coloidal combinado com o anticorpo IgY de cabra anti-galinha revela uma linha vermelha na linha de controlo (C). A linha de controlo (C) deve exibir uma linha ao testar amostras. A linha vermelha exibida na linha de controlo (C) é o padrão para avaliar se o processo de cromatografia decorreu corretamente e serve também como referencial de controlo interno para reagentes.
Componentes
O kit completo individual para a realização o teste com sucesso necessita de diversos componentes para assegurar a sua eficácia. A cassete de Teste ou placa reativa onde vai ser colocada a amostra recolhida é constituída por três componentes essenciais, a saber:
- Linha de teste (T): revestida com anticorpos SARS-CoV- 2;
- Linha de controle (C): revestida com anticorpo IgY anti-galinha de cabra;
- Almofada conjugada: revestida com complexo SARSCoV-2-ouro coloidal e complexo anticorpos IgY de galinha-ouro coloidal.
Para a extração da amostra e realização do teste é ainda necessário:
- Tubos de extração
- Reagentes de extração
- Bolsas de sílica
- Zaragatoa
Conservação e prazo de validade
O teste deve ser conservado a temperatura entre os 2°C e os 30°C. Não deve congelar o teste. Recomenda-se a utilização da cassete de teste no espaço de 30 minutos após a abertura da embalagem. Deve sempre consultar as embalagens para verificar o prazo de validade do kit.
Colheita de amostras e preparação
- O Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) é um imunoensaio de fluxo lateral rápido para deteção qualitativa e diagnóstico do SARS-CoV-2 diretamente de esfregaços nasais sem meio de transporte viral;
- Faça a colheita do esfregaço nasal de acordo com as diretrizes de colheita clínica de amostras de testes laboratoriais. Evite a contaminação durante a colheita, a transferência e a conservação das amostras;
- Para fazer a colheita da amostra de esfregaço nasal, insira cuidadosamente a zaragatoa na narina que apresente o corrimento mais visível, ou na narina mais congestionadas se o corrimento não for visível. Rodando suavemente, empurre a zaragatoa até haver resistência nos cornetos. Rode a zaragatoa 5 vezes contra a parede nasal por forma a recolher o máximo de células e muco possível. Repita este processo para a outra narina usando a mesma zaragatoa a fim de obter amostra de ambas as narinas.
Conservação de amostras
Para o melhor desempenho, os esfregaços nasais devem ser testados o mais breve possível após a colheita. Se a testagem imediata não for possível, e para manter o melhor desempenho e evitar uma possível contaminação, é altamente recomendado que a zaragatoa nasal seja colocada num tubo de plástico limpo e não usado, identificado com a informação do doente, preservando a integridade da amostra e
firmemente fechado a temperatura ambiente (15-30°C) durante até (1) hora antes da testagem. Assegure-se de que a zaragatoa nasal encaixa no tubo de forma segura e que a tampa está firmemente fechada. Se ocorrer um atraso superior a 1 hora, elimine a amostra. É necessário fazer a colheita de uma nova amostra para testagem
Extração da amostra
- Insira o tubo de extração no suporte de tubos de ensaio;
- Retire a tampa do reagente de extração, distribua todo o reagente pelo tubo de extração;
- Insira a zaragatoa no tubo de extração que contém o reagente de extração;
- Rode a zaragatoa pelo menos 6 vezes enquanto pressiona a parte de cima contra o fundo e os lados do tubo de extração;
- Coloque a zaragatoa no tubo de extração durante 1 minuto;
- A solução extraída será utilizada como amostra de teste.
Procedimento de teste
- Leia cuidadosamente as instruções de utilização antes de realizar o teste;
- Retire os kits 30 minutos antes do teste, assegure-se de que os testes e as amostras estão à temperatura ambiente;
- Coloque as cassetes de teste numa superfície plana e limpa; adicione 2 gotas de amostras extraídas desconhecidas ao orifício de amostra (S);
- Leia e registe os resultados após 10 minutos (Não mais do que 20 minutos). Podem ocorrer resultados anormais após 20 minutos.
Interpretação de resultados
Positivo (+):
A presença de duas linhas vermelhas, linha teste (T) e linha controlo (C), indica a presença de antigénio da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 na amostra.
Negativo (-):
Aparece uma linha vermelha na região de controlo (C). Nenhuma linha vermelha aparece na região teste (T). Indica a ausência de antigénio da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 na amostra.
Inválido:
A linha vermelha de controlo (C) não aparece. Um resultado inválido pode ser devido a procedimento incorreto ou a perda de eficácia do teste. Reveja todo o procedimento e repita o teste com uma nova cassete. Se o problema persistir, não utilize produtos do mesmo número de lote e contacte o distribuidor local ou o laboratório.
Desempenho
Reatividade cruzada
Não foram observados resultados falsos positivos no teste SARS-CoV-2 em amostras dos seguintes estados patológicos ou condições específicas, que vou listar na tabela seguinte:
| Vírus/bactéria | Resultado |
| Coronavirus Humano HKU1 | Negativo |
| Coronavirus Humano OC43 | Negativo |
| Coronavirus Humano NL63 | Negativo |
| Coronavirus Humano 229E | Negativo |
| Influenza Virus H1N1 novo tipo (2009) | Negativo |
| Virus influenza sazonal H1N1 | Negativo |
| H3N2 | Negativo |
| H5N1 | Negativo |
| H7N9 | Negativo |
| Yamagata para amostras positivas de influenza B | Negativo |
| Amostras positivas Victoria Influenza B | Negativo |
| Amostras positivas Rhinovirus Group A | Negativo |
| Amostras positivas Rhinovirus Group B | Negativo |
| Amostras positivas Rhinovirus Group C | Negativo |
| Amostras positivas vírus Humano cytomegalovirus | Negativo |
| Amostras positivas Norovirus | Negativo |
| Amostras positivas Virusa da Papeira | Negativo |
| Amostras positivas Varicella-zoster | Negativo |
| Virus sincicial Respiratorio (RSV) | Negativo |
| Virus Epstein-Barr | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 1 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 2 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 3 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 4 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 5 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 6 | Negativo |
| Adenovirus(ADV) tipo 7 | Negativo |
| HRV | Negativo |
| Enterovirus grupo A | Negativo |
| Enterovirus grupo B | Negativo |
| Enterovirus grupo C | Negativo |
| Enterovirus grupo D | Negativo |
| MAE | Negativo |
| Mycoplasma pneumoniae | Negativo |
| Candida albicans | Negativo |
| Amostra Normal | Negativo |
| HAV | Negativo |
| HBV | Negativo |
| HCV | Negativo |
| HEV | Negativo |
| HIV | Negativo |
| TB | Negativo |
| Dengue | Negativo |
| Helicobacter pylori | Negativo |
| MERS | Negativo |
Estudos de substâncias de interferência
Na análise da qualidade dos resultados não houve interferência para as substâncias potencialmente interferentes que descrevo na tabela seguinte:
| Substâncias | Concentração | Resultados |
| Sangue | 60 mg/mL | |
| Mucina | 2,5 mg/mL | |
| Zanamivir | 5,25 mg/mL | |
| Ribavirina | 5 mg/ml | |
| Oseltamivir | 7,5 mg/ml | |
| Levofloxacina | 3 mg/L | |
| Azitromicina | 1,35 mg/ml | |
| Tobramicina | 1,8 mg/L | |
| Acetonida de Triancinolona | 25 µg/mL | |
| Budesonida | 16,7 µg/mL | |
| Fluticasona | 1 mg/ml | |
| Beclometasona | 10 mg/ml | |
| Dexametasona | 375 µg/mL | |
| Furoato de Mometasona | 41.7 µg/mL | |
| Soro fisiológico | 1 mg/ml | |
| Oximetazolina | 15% v/v |
Limite de deteção (desempenho analítico)
O limite de detecção (LD) ou LOD do teste rápido Teste Rápido do Coronavírus Antigénio (nasal) ou TRAg (N), foi determinado pela avaliação de diferentes concentrações do vírus SARS-CoV-2 inativado. As amostras presumivelmente negativas foram eluídas em tampão e completamente misturadas para serem usadas como diluente clínico. O vírus SARS-CoV-2 inativado foi diluído neste pool de matriz de esfregaço para gerar diluições de vírus para teste.
Amostras de esfregaços artificiais foram preparadas absorvendo 20 microlitros de cada diluição de vírus no esfregaço. As amostras de zaragatoas artificiais foram testadas de acordo com o procedimento de teste. O LOD foi determinado como a concentração de vírus mais baixa que foi detetada ≥ 95% do tempo (isto é, concentração em que pelo
menos 19 de 20 réplicas testaram positivo). O LD confirmado do Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) foi de 1,6×102 TCID50/ml.
Desempenho clínico
O Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) foi avaliado com amostras obtidas de pacientes. Foi utilizado um teste molecular (PCR) comercializado como método de referência. Os resultados mostram que o Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) tem uma precisão relativa global alta. Com base nos resultados da avaliação clínica, foram apurados os seguintes desempenhos clínicos:
| Fator avaliado | Resultado |
| Sensibilidade | 95,7% |
| Especificidade | 99,1% |
| Taxa de precisão | 97,9% |
Os resultados absolutos da comparação de resultados entre o TRAg (N) e o teste PCR, foram os seguintes:
| Teste Rápido do Coronavírus Ag (N) | PCR Positivo | PCR Negativo | PCR Total | % certa |
| Positivo | 110 | 2 | 112 | 98,2% |
| Negativo | 5 | 209 | 214 | 97,7% |
| Total | 115 | 211 | 326 |
Limitações da tecnologia
- O conteúdo deste kit destina-se a ser utilizado para a deteção qualitativa de antigénios da proteína de nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 em esfregaços nasais.
- Pode ocorrer um resultado negativo se o nível de antigénios numa amostra estiver abaixo do limite de deteção do teste ou se a amostra tiver sido colhida ou transportada incorretamente.
- O incumprimento do Procedimento de Testagem pode afetar negativamente o desempenho do teste e/ou invalidar o resultado do teste.
- Os resultados do teste têm de ser avaliados em conjunto com outros dados clínicos disponibilizados ao médico.
- Podem ocorrer resultados falsos negativos se uma amostra for colhida, transportada ou manuseada incorretamente.
- Podem ocorrer resultados falsos se as amostras forem testadas 1 hora após acolheita. As amostras devem ser testadas o mais rapidamente possível após a colheita.
- Podem ocorrer resultados falsos negativos se for utilizado um reagente de extração inadequado.
- Podem ocorrer resultados falsos negativos se as zaragatoas forem conservadas nos seus invólucros de papel após a colheita das amostras.
- Resultados positivos não excluem coinfecções com outros patógenos.
- Os testes negativos não se destinam a incluir outras infeções bacterianas ou virais não-SARS.
- Resultados negativos de doentes com início de sintomas para além de sete dias devem ser tratados como presumíveis e poderá realizar-se uma confirmação com um teste molecular, se necessário para o tratamento do doente.
- Se for necessária a diferenciação de vírus e estirpes SARS específicos, terão de ser feitos testes adicionais, em concertação com os órgãos de saúde pública locais ou nacionais.
Precauções
- O produto destina-se apenas a diagnóstico in vitro. O resultado do teste não deve ser utilizado como o único índice para avaliar a condição do doente, e a manifestação clínica do doente e outros testes laboratoriais devem ser combinados para que se realize uma análise abrangente da situação.
- É necessário inspecionar a embalagem e a selagem do produto, bem como o prazo de validade, antes de realizar o teste.
- O teste deve ser realizado o mais depressa possível. A exposição prolongada do teste ao ar e à humidade irá causar resultados inválidos.
- A sobrecarga de amostras pode originar resultados inesperados, tais como falsos positivos.
- A precisão do teste pode ser afetada pela temperatura ambiente (<10°C ou >40°C) e pela humidade relativa (>80%)
Testes disponíveis para SARS-CoV-2
Como a pandemia COVID-19 é causada por um novo coronavírus, profissionais começaram a diagnosticar esta doença com base nas características clínicas e achados laboratoriais ao invés de métodos moleculares. No entanto, após o isolamento do RNA viral, vários laboratórios criaram testes de maior precisão para o diagnóstico da SARS-CoV2-2. Os testes laboratoriais atualmente disponíveis para o vírus são os seguintes:
- Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT PCR) em Tempo Real;
- Testes de deteção de antígeno;
- Testes sorológicos, com diferentes aplicações em momentos diferentes durante o curso da infeção.
RT-PCR em tempo real
A RT-PCR em tempo real é considerada o padrão ouro e testa a presença de RNA viral, principalmente utilizando amostras a partir de esfregaços da nasofaringe. No entanto, amostras de escarro, lavagem bronco alveolar, orofaringe e fezes também estão a ser testadas quanto à presença viral.
É denominada transcrição reversa porque transcreve o RNA de volta a DNA para aumentar a sua estabilidade. A OMS criou o primeiro protocolo em janeiro de 2020, com base em um protocolo de três etapas proposto por Corman e cols. para a deteção de SARS-CoV-2 por RT-PCR em tempo real.
Identificação do gene E, gene RdRP e gene N
A primeira etapa identifica o gene E (proteína de pequeno envelope) com um limite de deteção (LOD = menor concentração viral detetada) de 5,2 cópias de RNA/reação e um intervalo de confiança (IC) de 95% de 3,7-9,6. Em seguida, é realizado um ensaio confirmatório para detectar o gene RdRP (RNA-polimerase dependente de RNA) com um LOD de 3,8 cópias de RNA/reação e IC de 95% de 2,7-7,6 e gene N com um LOD de 8,3 cópias de RNA/reação e IC de 95% de 6,1-16,3.
O gene N (fosfoproteína nucleocapsídica) é usado como confirmação, pois é uma região altamente conservada nos coronavírus e provavelmente fornece resultados consistentes. O CDC nos Estados Unidos desenvolveu um kit que contém uma sonda de PCR de uma etapa para duas regiões do gene da fosfoproteína nucleocapsídica viral (N1 e N2) e para o gene da RNase P humana, para garantir que a extração de RNA seja bem-sucedida, diferindo do primeiro protocolo da OMS.
Chu e col. propuseram um outro fluxo de trabalho, que consiste no rastreio das amostras para o gene N, usando o gene ORF1b como confirmação. Se o último for negativo, o estudo é inconclusivo, e mais estudos sorológicos ou de sequenciamento de RNA deveriam ser realizados. Todos os ensaios têm uma alta sensibilidade e especificidade para a SARS-CoV-2, necessitando de um baixo limite de ciclos para um resultado positivo, e reatividade cruzada mínima com outros tipos de coronavírus.
Embora a RT-PCR tenha demonstrado detectar a presença viral em limiares baixos, é cedo no curso da doença para determinar a real sensibilidade do teste no COVID-19. Os resultados do ensaio podem sofrer alterações de acordo com a maneira como a amostra é tratada, o local em que a amostra foi colhida e o momento do teste. Isso pode significar que nem todos os pacientes negativos estão realmente livres de doenças.
Falsos negativos
Alguns estudos relataram casos de pacientes com resultado inicial negativo de PCR de uma amostra nasofaríngea, que mais tarde desenvolveram sintomas e depois testaram positivo em amostras de lavado broncoalveolar. Esta taxa de falsos negativos em fases iniciais é preocupante no rastreio da doença, e pode resultar em falha no isolamento tempestivo de pacientes. Além disso, a PCR pode ser positiva em saliva e swab nasofaríngeo nos primeiros 14 dias da doença e, em seguida, torna-se negativa, enquanto a PCR fecal pode detetar o vírus mais tarde e continuar positiva por períodos mais longos. Portanto, testes periódicos de diferentes amostras podem ajudar a aumentar a sensibilidade e a reduzir a taxa de falsos negativos.
Testes sorológicos
Os testes sorológicos são feitos no sangue para identificar anticorpos para um patógenio específico em um determinado momento. Como afirmado acima, a IgM representa uma infecção aguda, enquanto a IgG, crónica. Existem vários testes que podem ser realizados para avaliar a presença de anticorpos:
1) Teste de diagnóstico Rápido (RDT): é uma medida qualitativa da presença de anticorpos, com resultados em 30 minutos, que foi disponibilizado por meio de uma autorização de uso emergencial do FDA. De acordo com o rótulo, possui uma sensibilidade de 93,8% e uma especificidade de 95,6%;
2) Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA): é um teste que pode ser qualitativo ou quantitativo e utiliza amostras de sangue total, plasma ou soro. O teste utiliza uma placa revestida com proteína viral, onde as amostras são incubadas. Se os anticorpos estiverem presentes, eles ligam-se a esta proteína específica e este complexo proteína-anticorpo pode mais tarde ser detetado por ligação a um novo lote de anticorpos fluorescentes. Existem algumas preocupações sobre a reatividade cruzada de anticorpos contra SARS-CoV-2 e outros coronavírus.
3) Teste de neutralização: este teste pode dizer se os anticorpos são ativos contra o vírus. O vírus é cultivado em células VeroE6 e os pesquisadores podem quantificar os anticorpos que bloqueiam a replicação viral. Um estudo demonstrou que a IgG neutraliza o SARS-CoV-2 a uma diluição de 1:40-1:80, e também confirmou a neutralização cruzada com SARS-CoV em diluições 1:40. Os resultados deste teste podem levar dias e pode haver perda de anticorpos para proteínas virais não envolvidas na replicação viral.
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